银河国际官网由一张微生物检验报告单引发的思考——D实验和MLS
无乳链球菌首选的治疗药物是青霉素和氨苄西林，由于对此两种药物表现为“非敏感”的菌株极为罕见，所以临床上无需常规检测无乳链球菌对青霉素和β-内酰胺类药物（批准用于治疗无乳链球菌感染）的药敏。对青霉素、氨苄西林和头孢唑林敏感的B群链球菌，可能对红霉素和克林霉素耐药，需检测红霉素、克林霉素（包括D实验）的药敏，但只报告克林霉素的药敏结果。
患者女，49岁，入院前3天患者自觉左侧外阴肿痛，有压痛，穿紧身裤及坐位时明显，伴伤口处分泌物增多，呈脓性，有异味，伴外阴轻微瘙痒，门诊以“左侧前庭大腺脓肿”收入院。
我院检验科微生物组收到前庭大腺脓液1份，标本接种血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，置于5%CO2培养箱培养24小后，血琼脂培养接可见少量灰白色、湿润、中等大小、有小β溶血的可疑菌落生长，对该菌落进行革兰染色，为革兰阳性球菌，部分呈链状排列（图1）。
该菌触酶阴性，经分纯后(图2)，挑取单独菌落做CAMP试验（左侧为ATCC29213，右侧为ATCC25923），结果为阳性（图3），怀疑为无乳链球菌，及时与临床医师沟通。
挑取单独分纯菌落，使用BD PhoenixTM链球菌鉴定卡鉴定，结果为无乳链球菌，同时使用BD PhoenixTM链球菌药敏卡，按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的M100标准文件进行耐药分析，结果为：青霉素、万古霉素、利奈唑胺、美罗培南、头孢噻肟、头孢吡肟敏感，克林霉素、红霉素、左旋氧氟沙星耐药（图4）。仪器专家系统提示：分离株为MLSB耐药的链球菌属(图5)。这样的结果引起了笔者进一步的思考：MLSB耐药和上述的药敏有什么联系？我们非常熟悉的诱导性克林霉素耐药试验和MLSB耐药是怎么相关的呢？
红霉素诱导克林霉素耐药试验，适用范围：葡萄球菌、肺炎链球菌、β溶血链球菌，使用条件：红霉素（R）+克林霉素（S/I），操作方法：纸片扩散法（D试验）、微量肉汤稀释法，结果判读：与红霉素相邻侧抑菌圈出现“截平（即D抑菌圈）”即“诱导性克林霉素耐药”，克林霉素抑菌圈内出现弥漫性生长（即使未出现D抑菌圈）即“克林霉素耐药”，阳性结果应报告克林霉素耐药，报告中可评注“由于检测出诱导性克林霉素耐药，推测此菌株对克林霉素耐药”。
MLSB耐药表型：大环内酯类（Macrolides）、林可胺类（Lincosamides）和链霉素B（Streptogramins B）这三种药物的抑菌机制相似，均是结合细菌核糖体50s亚基、抑制细菌蛋白质翻译，从而达到抑菌效果。所以当细菌核糖体50s亚基发生二甲基化时，可使细菌同时对三种药物产生交叉耐药的现象，有此种耐药表现的细菌被称为是MLSB耐药表型。
二甲基化是由细菌体内的甲基化酶催化的，而甲基化酶是由erm基因表达的。“erm基因”是“红霉素核糖体甲基化酶（erythromycin ribosomal methylase）”的缩写，此基因可存在于葡萄球菌属、链球菌属和肠球菌。MLSB耐药表型可分为“cMLSB耐药表型（结构型，constitutive）”和“iMLSB耐药表型（诱导型，inducible）”,当erm基因持续表达时，细菌核糖体50s亚基被甲基化，此时细菌可表现出对以上三类抗生素交叉耐药，即为cMLSB耐药表型。
iMLSB耐药表型正是D试验阳性的原因（图6）：若细菌携带erm基因，红霉素先于克林霉素扩散到a区，诱导细菌发生甲基化酶表达，导致a区细菌对克林霉素耐药，而b区克林霉素先于红霉素扩散，b区的细菌对克林霉素仍是敏感的，因此出现截平现象，形如大写D字样。若D试验阴性，表示该菌不存在erm基因，克林霉素敏感，可用于抗感染治疗。
大环内酯类药物可诱导携带erm基因的细菌对三类药物（M-L-SB）产生交叉耐药。但克林霉素无此诱导作用。所以，诱导性克林霉素耐药的产生需要三个要素：细菌携带erm基因，细菌先受到过大环内酯类药物诱导，最后细菌接触克林霉素时，对其耐药。我国金葡萄球菌、A/B组链球菌对克林霉素耐药率高，因此不建议国内应用克林霉素治疗此种病原体所致感染。
[1]周庭银等，临床微生物诊断与图谱（第四版），上海：上海科学技术出版社，2017:507-519.
[3]陈瑶,裴光德,李娟等.克林霉素耐药型金葡萄球菌耐药基因与生物膜形成能力分析[J].现代医药卫生,2022, 38 (01): 11-15.
