银河国际官网《iMeta》综述 多组学在肿瘤微生物研究中的应用

　　尽管存在着肿瘤内微生物含量低且TME异质性高等问题，但单细胞多组学的发展必将克服这些难题，成为肿瘤微生物组研究中最有力的工具。

　　作者单位：俄亥俄州立大学医学院放射肿瘤学系、俄亥俄州立大学詹姆斯综合癌症中心癌症代谢中心、俄亥俄州立大学医学院生物化学和药理学系肿瘤微生物在肿瘤发生、发展、转移和治疗过程中起着重要作用，且极有可能成为肿瘤早期诊断和治疗的标志物，但同时也存在一定的挑战，如肿瘤内微生物含量低和不可培养，因此亟需新的高分辨率的技术来支持后续的研究。多组学技术（基因组学，转录组学，蛋白质组学和代谢组学）能从不同层次阐述肿瘤微生物，将对未来微生物与肿瘤微环境相互作用的研究产生巨大影响。本文系统总结了多组学技术的研究进展及其在肿瘤微生物组研究中的应用，为研究者提供了一个可供参考的组学工具箱。

　　肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)中存在微生物并受其影响，目前地球上大约有1012种已知的微生物，只有11种被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)确认为“肿瘤微生物”。研究人员发现微生物存在于多种肿瘤中（乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、皮肤癌、肾细胞癌，胃癌、肺癌、前列腺癌和鼻咽癌等；图1），而且不同类型肿瘤中的微生物有惊人的相似之处。肿瘤内微生物通过DNA损伤、致癌激活途径、抗肿瘤药物分解代谢和免疫系统调节等多种机制影响肿瘤的发展和治疗（如：大肠杆菌释放能够诱导致癌DNA突变的基因毒素；幽门螺杆菌通过诱导炎症和影响调节粘膜细胞生长和增殖的关键细胞内信号通路；用于治疗胰腺导管腺癌的化疗药物吉西他滨被肿瘤内细菌代谢至失活状态，从而导致耐药性）。

　　基因组学和转录组学专注于研究参与基因表达调控的核酸（DNA和RNA）。目前，使用最广泛的测序技术（图2）包括三种二代测序系统（即Illumina、Ion Torrent、BGI）和两种三代测序技术（即PacBio和纳米孔）。这些测序方法（DNA测序，RNA测序，16S rRNA测序，表观遗传学测序（如ChIP-seq和DNA/RNA甲基化测序）和三维基因组技术）是发展各种基因组和转录组研究方法的基础。此外，基因编辑工具的最新研究进展已经能够在全基因组水平上进行多基因操作。

　　DNA-seq通常用于三种类型的基因组分析：全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)、全外显子测序(whole exome sequencing, WES)和靶向测序。随着DNA技术的快速发展，DNA-seq正成为研究不可培养微生物（包括人类微生物组中的微生物）的有力工具。基因组文库的测序和异源表达极大地促进了我们对代谢途径和肿瘤微生物生理的理解。

　　16S rRNA测序是一种专门针对细菌和古细菌表达的30S核糖体亚单位16S的测序技术；该序列包含交替的高度保守和高变区；保守区可用于设计扩增靶向片段的通用引物，而高变区的分析可用于鉴定特定的细菌物种，尽管一些注释可能低于物种水平。在肿瘤微生物组领域，16S rRNA测序主要用于研究群落中物种的组成、物种间的进化关系以及微生物群落多样性。

　　RNA-seq是一种转录组测序方法，其中高通量测序方法用于研究复杂样品中不同RNA的群体，包括信使RNA(messenger RNA, mRNA)、转运RNA(trainsfer RNA, tRNA)、非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)和微小MicroRNA(micro RNA, miRNA)等。在过去几十年里，RNA-seq技术已成为在转录组水平上分析基因表达不可或缺的工具。在RNA生物学领域，RNA-seq已广泛应用于研究单细胞基因转录、蛋白质表达和RNA结构。RNA-seq技术的进步也进一步促进了空间转录组学的出现和发展；直接长阅读或全长RNA-seq方法、以及不断更新的数据分析方法，使研究人员能够更好地了解RNA生物学（包括转录过程机制以及折叠和分子间相互作用对RNA功能的影响）。总的来说，RNA-seq是通过基因转录水平上的分析来研究癌细胞和肿瘤微生物组通路交互影响的强有力工具。

　　表观遗传学研究不涉及DNA序列改变的表型变化。与遗传调节不同，典型的表观遗传变化（包括DNA/RNA修饰和组蛋白翻译后修饰）是可逆的，且不影响细胞基因组序列。在真核细胞中，核小体作为染色质组织的基本重复单位，主要由围绕核心组蛋白八聚体缠绕1.5次的147个碱基对组成（如两拷贝H2A、H2B、H3和H4）。DNA、RNA和组蛋白的共修饰是调控特定基因激活和抑制的关键机制。表观遗传调控在研究与人类疾病特别是癌症密切相关的DNA复制、转录和损伤修复过程中起重要的调控作用。

　　DNA甲基化在不改变基因序列的情况下调控转录，而肿瘤抑制相关基因表达的关闭会导致肿瘤的发生。大量研究表明DNA异常甲基化与多种肿瘤的发生发展密切相关，因而DNA甲基化水平的改变常被检测为肿瘤诊断的标志。目前，已经开发了多种DNA甲基化测序技术，如全基因组亚硫酸氢盐测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)，简化的亚硫酸氢盐测序(Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)，氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-seq)和无细胞甲基化DNA免疫沉淀和高通量测序(cfMeDIP-seq)。

　　组蛋白翻译后修饰(Post-translational Modifications, PTMs)包括甲基化、磷酸化、乙酰化、巴豆酰化、泛素化、糖基化、糖化和ADP核糖基化，不同组蛋白PTMs被认为与癌症的发生发展有关，如微生物的甲基乙二醛合酶(methylglyoxal synthases, MGSs)可以促进TME中甲基乙二醛的生成；组蛋白MGO(methylglyoxal)-糖基化被发现通过影响染色质的三维结构影响肿瘤的发展。

　　此外，染色质免疫沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)是基因转录水平组蛋白修饰的最常用方法之一，该技术起初主要用于研究蛋白和DNA的相互作用。ChIP技术主要用于研究胞内相互作用和对研究基因水平的表观遗传学改变；ChIP-seq结合了ChIP和二代DNA测序技术，可以有效地检测特定组蛋白修饰和转录因子的DNA结合位点。ChIP-seq的原理为：DNA片段纯化与目标蛋白质结合并通过ChIP纯化富集和免疫共沉淀，然后纯化并构建文库，富集的DNA片段通过高通量技术进行测序；借助该技术，研究人员已经精确定位了基因组中与特定组蛋白相互作用的序列和转录因子。对于肿瘤微生物组研究而言，ChIP-seq技术适用于宿主和微生物细胞的基因组或表观遗传学研究。

　　与肿瘤微生物组相关的研究主要集中于宿主细胞的真核基因组，最近Hi-C技术开始用于细菌染色体的研究，为生物样本DNA序列的物理邻近性提供依据。

　　肿瘤微生物组研究领域，基因编辑技术已广泛用于宿主和微生物，发现肠道微生物的基因组组成变化很大。单核苷酸多态性(SNPs)的系统发育分析显示了全球宏基因组样本中显著的种内遗传变异。因为我们可以看出CRISPR‐Cas9技术在菌群研究领域有较好的应用前景。

　　基因组和转录组学方法能提高覆盖率同时降低假阳性，但组装正确率取决于测序深度和群落复杂性，如宏基因组技术能研究复杂群体的细菌组成，但低丰度菌的序列可能被高丰度生物的序列掩盖。此外，具有相似表型的细胞中的遗传信息可能存在显著差异，且低丰度信息可能会丢失。单细胞测序技术弥补这些局限性的同时，可以揭示单个细胞的基因结构和基因表达，同时能更好地反映细胞间的异质性。

　　目前单细胞基因组和转录组主要基于4种研究方法：琼脂平板稀释、基于精细毛细管移液分离和倒置显微镜的单细胞外显子组测序、基于液滴的微流体技术和改进的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法，而其中关键的一步是从组织或其他来源制备单细胞悬液。

　　通过平板划线获得单一微生物的纯培养物，然后反复稀释微生物或不同细胞类型的混合物，从而将不同的群落分离成单细胞，这些单细胞将生长成同质菌落（图3A）。微流控划线平板(microfluidic streak plate, MSP)技术基于微流控的传统平板划线技术。MSP使用微流体得到微液滴，在培养皿上划线培养单细胞。传统琼脂平板稀释和MSP都可以整合到高通量筛选工作流程中。

　　组织样本的细胞悬浮液在倒置显微镜下用口吸毛细管系统或其他单细胞移液系统进行处理得到单细胞。分离的单细胞经确认后随机置于PCR管中，然后通过全基因组扩增(whole genome amplification, WGA)获得基因组序列信息，同时可用于外显子组测序（图3A）。这种技术已被用于研究肾细胞癌和邻近肾组织的研究，发现肿瘤的发生比以前认为的更复杂，并促进了更有效的细胞靶向治疗的发展。由此我们也可以断定，这种方法也可用于研究单个肿瘤细胞内的微生物的研究。

　　该方法主要用于基于两种不相容的液体来制备液滴，液滴的产生主要基于微管结构和两种液体之间的流速（图3A），固定流速的泵驱动两种液体进入不同的微通道，当它们相遇便产生微滴；这些液滴是理想的微反应室，可容纳单个细胞。单个液滴可通过系统进行填充、操作、分离、组合、检测和分类，从而得到数千个液滴。微滴微流体可以从大量细胞群中分离出单个细胞，通过一系列酶促步骤提取和分割基因组，遗传物质被扩增和标记后进行单细胞测序。该技术结合了微流体技术、DNA条形码和测序技术。

　　被包埋的微生物可以直接在液滴中培养，并在第一次扩增过程中生长上百个细胞，然后裂解纯化，用细胞分选仪将含有单细胞扩增DNA的珠子分选到标准PCR板中，随后再扩增到单细胞扩增基因组(single‐cell amplified genome, SAG)文库中。基于SAG-gel平台的典型单细胞测序方法（图3A）的微流控液滴发生器已用于在琼脂糖凝胶珠中培养小鼠肠道微生物。

　　包埋的单一微生物也可以直接裂解，然后进行DNA扩增或RNA逆转录和条形码标记。对于单细胞基因组测序，细胞通常首先被扩增，然后进行标记；单细胞转录组测序，通常首先标记细胞RNA，然后逆转录，最后是互补DNA(cDNA)扩增（图3A）。为了研究细胞内的核小体，核小体必须首先用条形码标记，然后进行免疫沉淀(single-cell ChIP-seq)和DNA扩增（图3A）。微滴微流体技术可以分析数百万个独立的反应，目前该技术也被用于单个DNA分子的深度测序，通过单细胞芯片测序和高通量分析对被标记的核小体进行分析。

　　微滴微流控单细胞测序无需单独培养微生物即可对细胞进行测序。通过这种方法，可以得到宏基因组数据库以研究肿瘤和其他区域（如肠道）中的微生物。这种方法的局限性在于，它从单拷贝基因组开始，但在酶和微流体处理过程中信息的损失不可避免，从而降低单个细胞信息的覆盖率。

　　荧光原位杂交(FISH)是研究培养微生物的重要工具，可用于鉴定单细胞，也可用于标记靶向RNA（图3B）。RNA拷贝数可以反应在荧光水平上，因此该技术尤其适用于靶向rRNA的检测。16S rRNA不同区域的保守度不一样，可以根据菌类型设计特异性的引物。

　　为解决分辨率低的问题，研究者们又开发了一些其他的方。